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Applications

APPLICATION

Measuring The Size, Concentration And Type of cell Exosomes By Using A Combination Method of Raman Microscopy And Adjustable Resistive Pulse Sensing (TRPS)

利用顯微拉曼光譜和可調(diào)式阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)組合方法測量細(xì)胞外泌體的尺寸、濃度和種類
 

利用顯微拉曼光譜和可調(diào)式阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)組合方法測量細(xì)胞外泌體的尺寸、濃度和種類
 

簡介
 
細(xì)胞會釋放囊泡，例如外泌體和微泡。這些由雙層磷脂包裹的球狀微粒比人體內(nèi)最小的細(xì)胞還要再小100倍。

圖1. 人類尿液內(nèi)囊泡的電鏡圖像
 
 
圖1顯示了投射電鏡下人類尿液里的囊泡。由于細(xì)胞會把囊泡釋放到周圍環(huán)境和體液中，故血液，唾液和尿液當(dāng)中都含有大量的細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡。
 
細(xì)胞利用囊泡來排出廢棄物及運輸物質(zhì)，例如把受體和基因信息運輸?shù)狡渌?xì)胞。既然所運輸?shù)奈镔|(zhì)允許囊泡對特定的細(xì)胞傳輸信息，那么囊泡自然在細(xì)胞間的通信中扮演了關(guān)鍵的角色。此外，體液中的囊泡，其尺寸，濃度，細(xì)胞源及組分會隨著疾病而產(chǎn)生變化。比如，血漿中囊泡數(shù)量的增加通常與血栓和轉(zhuǎn)移癌癥有關(guān)。囊泡的功能以及它們在病癥期間性質(zhì)的變化表明了囊泡有很多臨床的應(yīng)用。比如特定種類囊泡數(shù)量的劇增可能預(yù)示著某種疾病的出現(xiàn)。獲得這些信息對病癥的診斷和監(jiān)視治療效果有著很大的幫助。
 
此外，囊泡可以用來將藥物直接送到患病器官處而又不會被人體的免疫系統(tǒng)清除掉。為了使這些應(yīng)用成為現(xiàn)實，我們需要一種能對囊泡種類進行鑒別，并對囊泡的尺寸和濃度進行檢測的儀器。
 
方法
 
圖2.可調(diào)阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)示意圖 – 與纖維拉曼光譜混合
 
為了檢測出特定種類囊泡的尺寸和濃度，使用可調(diào)阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)與纖維拉曼光譜聯(lián)合測試的方法。 圖2為這種方法的示意圖。TRPS由兩種液體單元組成，被一層不導(dǎo)電的絕緣膜隔開。電流通過絕緣膜上的單個小孔流動，小孔直徑小于1um。電流的變化與囊泡量近似成正比關(guān)系。通過在兩個液體單元之間施加不同的壓力，由壓力驅(qū)動的液體流動作用比電泳電滲和擴散效應(yīng)帶來的液體流動要更強，因此壓力驅(qū)動的流動占主要地位。系統(tǒng)由已知尺寸和濃度的液珠進行校正，所以囊泡的計數(shù)率就跟囊泡的尺寸和濃度相關(guān)了。所以，TRPS可以用來檢測囊泡尺寸的分布和懸浮液內(nèi)的囊泡濃度。
 
囊泡通過膜上小孔后，會被785nm激光光束的光鑷效應(yīng)俘獲。囊泡的斯托克斯拉曼散射被光譜儀收集（Holospec F/18i， Andor公司體光柵光譜儀, DU920P-BR-DD, Andor 公司CCD），每一種細(xì)胞的囊泡都有其特征的拉曼光譜，因而，拉曼光譜很可能也包含了囊泡的細(xì)胞源信息。
 
拉曼光譜法的優(yōu)勢在于：
1、可量化；
2、無需標(biāo)記。
相比之下，絕大多數(shù)實驗室使用熒光抗體標(biāo)記的方法來鑒定囊泡，這種方法既費事又會引入其他問題，如抗體通常不僅會跟抗原結(jié)合，還會跟Fc受體結(jié)合。
 
測試結(jié)果
 
圖3.尿液囊的尺寸分布以及濃度
 
我們改進了TRPS系統(tǒng)上層液體，(Izon Science Ltd, Christchurch, New Zealand) 使膜孔有了光學(xué)延展性。改進之后，我們評估了TRPS檢測人體尿液囊泡的尺寸和濃度。之所以選擇尿液囊泡，是因為尿液里含有較高濃度的尿液囊泡，同時脂蛋白和蛋白質(zhì)集結(jié)的污染程度較小。圖3顯示了用TRPS測量的尿液囊泡的尺寸分布以及濃度，尿液囊泡的濃度隨著尺寸的增加而降低，我們能檢測到的最小尺度的尿囊為100nm直徑
 
圖4.單血小板源性囊泡的拉曼光譜圖。拉曼峰表征了出現(xiàn)在這種囊泡內(nèi)的特征化學(xué)成分
 
TRPS的顯微擴展使激光可以聚焦到小孔上，并用光鑷的方法俘獲單個囊泡，從而獲取單個囊泡的拉曼光譜。圖4為單血小板源性囊泡的拉曼光譜圖。拉曼峰表征了出現(xiàn)在這種囊泡內(nèi)的特征化學(xué)成分。
 
結(jié)論和展望
體液包含源于細(xì)胞而存在于細(xì)胞外的囊泡，包含了有用的臨床信息。在生理病理學(xué)條件下研究這些囊泡的作用，并將囊泡運用于疾病的生物標(biāo)記。我們研發(fā)了一種新型的TRPS-拉曼的聯(lián)合應(yīng)用使得我們可以通過TRPS檢測到百納米量級的囊泡，并對單個血小板源性囊泡的拉曼光譜進行了采集，下一步我們還將這種方法應(yīng)用去其他種類囊泡的研究。