利用顯微拉曼光譜和可調(diào)式阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)組合方法測(cè)量細(xì)胞外泌體的尺寸、濃度和種類(lèi)
利用顯微拉曼光譜和可調(diào)式阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)組合方法測(cè)量細(xì)胞外泌體的尺寸、濃度和種類(lèi)
利用顯微拉曼光譜和可調(diào)式阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)組合方法測(cè)量細(xì)胞外泌體的尺寸、濃度和種類(lèi)
簡(jiǎn)介
細(xì)胞會(huì)釋放囊泡，例如外泌體和微泡。這些由雙層磷脂包裹的球狀微粒比人體內(nèi)*小的細(xì)胞還要再小100倍。
圖1. 人類(lèi)尿液內(nèi)囊泡的電鏡圖像
圖1顯示了投射電鏡下人類(lèi)尿液里的囊泡。由于細(xì)胞會(huì)把囊泡釋放到周?chē)h(huán)境和體液中，故血液，唾液和尿液當(dāng)中都含有大量的細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡。
細(xì)胞利用囊泡來(lái)排出廢棄物及運(yùn)輸物質(zhì)，例如把受體和基因信息運(yùn)輸?shù)狡渌?xì)胞。既然所運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)允許囊泡對(duì)特定的細(xì)胞傳輸信息，那么囊泡自然在細(xì)胞間的通信中扮演了關(guān)鍵的角色。此外，體液中的囊泡，其尺寸，濃度，細(xì)胞源及組分會(huì)隨著疾病而產(chǎn)生變化。比如，血漿中囊泡數(shù)量的增加通常與血栓和轉(zhuǎn)移癌癥有關(guān)。囊泡的功能以及它們?cè)诓“Y期間性質(zhì)的變化表明了囊泡有很多臨床的應(yīng)用。比如特定種類(lèi)囊泡數(shù)量的劇增可能預(yù)示著某種疾病的出現(xiàn)。獲得這些信息對(duì)病癥的診斷和監(jiān)視治療效果有著很大的幫助。
此外，囊泡可以用來(lái)將藥物直接送到患病器官處而又不會(huì)被人體的免疫系統(tǒng)清除掉。為了使這些應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)，我們需要一種能對(duì)囊泡種類(lèi)進(jìn)行鑒別，并對(duì)囊泡的尺寸和濃度進(jìn)行檢測(cè)的儀器。
方法
圖2.可調(diào)阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)示意圖 – 與纖維拉曼光譜混合
為了檢測(cè)出特定種類(lèi)囊泡的尺寸和濃度，使用可調(diào)阻性脈沖感應(yīng)(TRPS)與纖維拉曼光譜聯(lián)合測(cè)試的方法。 圖2為這種方法的示意圖。TRPS由兩種液體單元組成，被一層不導(dǎo)電的絕緣膜隔開(kāi)。電流通過(guò)絕緣膜上的單個(gè)小孔流動(dòng)，小孔直徑小于1um。電流的變化與囊泡量近似成正比關(guān)系。通過(guò)在兩個(gè)液體單元之間施加不同的壓力，由壓力驅(qū)動(dòng)的液體流動(dòng)作用比電泳電滲和擴(kuò)散效應(yīng)帶來(lái)的液體流動(dòng)要更強(qiáng)，因此壓力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)占主要地位。系統(tǒng)由已知尺寸和濃度的液珠進(jìn)行校正，所以囊泡的計(jì)數(shù)率就跟囊泡的尺寸和濃度相關(guān)了。所以，TRPS可以用來(lái)檢測(cè)囊泡尺寸的分布和懸浮液內(nèi)的囊泡濃度。
拉曼光譜法的優(yōu)勢(shì)在于：
1、可量化；
2、無(wú)需標(biāo)記。
相比之下，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用熒光抗體標(biāo)記的方法來(lái)鑒定囊泡，這種方法既費(fèi)事又會(huì)引入其他問(wèn)題，如抗體通常不僅會(huì)跟抗原結(jié)合，還會(huì)跟Fc受體結(jié)合。
測(cè)試結(jié)果
圖3.尿液囊的尺寸分布以及濃度
我們改進(jìn)了TRPS系統(tǒng)上層液體，(Izon Science Ltd, Christchurch, New Zealand) 使膜孔有了光學(xué)延展性。改進(jìn)之后，我們?cè)u(píng)估了TRPS檢測(cè)人體尿液囊泡的尺寸和濃度。之所以選擇尿液囊泡，是因?yàn)槟蛞豪锖休^高濃度的尿液囊泡，同時(shí)脂蛋白和蛋白質(zhì)集結(jié)的污染程度較小。圖3顯示了用TRPS測(cè)量的尿液囊泡的尺寸分布以及濃度，尿液囊泡的濃度隨著尺寸的增加而降低，我們能檢測(cè)到的*小尺度的尿囊為100nm直徑
圖4.單血小板源性囊泡的拉曼光譜圖。拉曼峰表征了出現(xiàn)在這種囊泡內(nèi)的特征化學(xué)成分
TRPS的顯微擴(kuò)展使激光可以聚焦到小孔上，并用光鑷的方法俘獲單個(gè)囊泡，從而獲取單個(gè)囊泡的拉曼光譜。圖4為單血小板源性囊泡的拉曼光譜圖。拉曼峰表征了出現(xiàn)在這種囊泡內(nèi)的特征化學(xué)成分。
結(jié)論和展望
體液包含源于細(xì)胞而存在于細(xì)胞外的囊泡，包含了有用的臨床信息。在生理病理學(xué)條件下研究這些囊泡的作用，并將囊泡運(yùn)用于疾病的生物標(biāo)記。我們研發(fā)了一種新型的TRPS-拉曼的聯(lián)合應(yīng)用使得我們可以通過(guò)TRPS檢測(cè)到百納米量級(jí)的囊泡，并對(duì)單個(gè)血小板源性囊泡的拉曼光譜進(jìn)行了采集，下一步我們還將這種方法應(yīng)用去其他種類(lèi)囊泡的研究。
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